當黑線倉鼠受到外界刺激時它們會發出激烈的叫聲，黑線倉鼠對自己的生活習慣要求很高，它們的、食、便處從不混用，
一般一個洞穴內只有1只成體鼠，幼鼠和亞成體鼠與母鼠分居，在距母巢35～100m處建築洞穴。母鼠與幼鼠在同一領域內呈圓形分佈，在其領域內幾乎沒有其它鼠類建築洞穴，但允許在其範圍內繞行活動。雌雄比1∶3.7。黑線倉鼠可在距離洞穴80～200m的範圍內活動，但以80～150m範圍內活動最頻繁，雨後較晴天活動頻繁，冬季活動範圍小，主要依靠存糧為生。5～6月和10～11月為數量高峰期，不冬眠。該鼠食性雜，以小麥、玉米、豆類等作物的種子為主要食料，占食料的60%以上，雜草籽次之，占20%，還取食少量昆蟲和植物莖、葉、根等。
